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摘要：基于前期研究中获得的１４个苹果茎痘病毒（ＡＳＰＶ）分离物，将其分别接种于不同草本、木本指示植物，分析其在不同寄主上的症状变化特点。结果显示，ＡＳＰＶ各分离物只局部侵染草本指示植物西方烟（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ），而均未引起系统侵染；不同分离物接种的西方烟各植株症状没有明显差别。在木本指示植物中，所有分离物皆侵染杂种榅桲（Ｐｙｒｏｎｉａｖｅｉｔｃｈｉｉ）和Ｓｐｙ２２７，部分分离物不侵染光辉（R65-76Radiant），仅少数病毒分离物在梨品种考密斯（ＤｏｙｅｎｎｅｄｕＣｏｍｉｃｅ）上显示症状。总体来看，杂种榅桲最适合做ＡＳＰＶ的指示植物，其次为Ｓｐｙ２２７，最后是光辉。不同分离物在不同指示植物上的症状较复杂，并未呈现明显规律性，因而单纯以生物学症状特点难以进行系统的ＡＳＰＶ株系分化分析。

 

　　关键词：苹果茎痘病毒（ＡＳＰＶ）；检测；指示植物

 

　　苹果茎痘病毒（ＡＳＰＶ）是一种严重危害果树生产的潜隐性病毒。ＡＳＰＶ主要侵染苹果和梨，ＡＳＰＶ常与苹果退绿叶斑病毒（ＡＣＬＳＶ）、苹果茎沟病毒（ＡＳＧＶ）等混合侵染，导致苹果和梨产量降低，品质变劣［１］。

 

　　ＡＳＰＶ在中国危害较严重，植株带毒率普遍较高。刘福昌等［２］报道我国的渤海湾、黄河故道和西北高原苹果主产区主栽苹果品种和营养系矮生砧木普遍受ＡＳＰＶ、ＡＳＧＶ、ＡＣＬＳＶ侵染，其中ＡＳＰＶ带毒率普遍高于５０％，金冠、元帅的带毒率则高于８０％。王国平等［３］研究结果表明我国北方梨产区主栽品种上ＡＳＰＶ的平均带毒率为６１．８％。

 

　　生物学方法长期以来一直是进行病毒鉴定及株系划分最基础的方法之一，主要通过病毒汁液摩擦接种、二重芽接法等方式接种于寄主植物上，根据寄主症状表现及寄主范围来对病毒或病毒株系进行鉴定［４］。该方法的结果较直观，适合基层农技人员使用，此外，也利于发现新的病毒株系。基于前期研究中获得的１８个ＡＳＰＶ分离物，本研究将其分别接种于不同草本、木本寄主植物，分析其在不同寄主上的症状变化特点，并进一步探索基于生物学方法对ＡＳＰＶ进行株系分化研究。

 

　　１材料和方法

 

　　１．１植物材料

 

　　采集苹果样本，利用ＲＴ－ＰＣＲ技术和ＥＬＩＳＡ技术检测ＡＣＬＳＶ、ＡＳＧＶ和ＡＳＰＶ的侵染情况［５］，确定仅受ＡＳＰＶ侵染的样本进行后续研究，共获得了１４个ＡＳＰＶ分离物，分别命名为ｐｖ２、ｐｖ４、ｐｖ５、ｐｖ６、ｐｖ７、ｐｖ９、ｐｖ１０、ｐｖ１１、ｐｖ１３、ｊｆ１、ｊｆ２、ｊｆ３、ｊｆ４、ｊｆ５。

 

　　草本指示植物为西方烟（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）３７Ｂ；木本指示植物包括Ｓｐｙ２２７、光辉（Ｒ６５－７６Ｒａｄｉａｎｔ）和杂种榅桲（Ｐｙｒｏｎｉａｖｅｉｔｃｈｉｉ），梨品种考密斯（ＤｏｙｅｎｎｅｄｕＣｏｍｉｃｅ）。

 

　　１．２病毒汁液摩擦接种

 

　　温室播种西方烟，待西方烟长到３～４叶时进行接种。研钵放于１８０℃烘箱灭菌，然后将研钵和接种缓冲液置冰上预冷；向西方烟叶片撒上金刚砂（１０００目），取出待检样品叶片，加入２～５倍（Ｗ／Ｖ）接种缓冲液和少许金刚砂，低温条件下迅速研磨，用研磨棒蘸取汁液，轻轻涂抹叶面，蒸馏水冲洗接种叶面，每个样品分别用两种缓冲液重复４次，放置温室观察。

 

　　１．３二重芽接法

 

　　播种砧木山定子和杜梨，第二年定植实生苗，之后进行二重芽接，接种受ＡＳＰＶ感染接穗（ＲＴ－ＰＣＲ检测显示未受ＡＳＧＶ和ＡＣＬＳＶ感染）［５］。当指示植物如苹果时用山定子作砧木，为梨时则用杜梨作砧木。先将供试毒源样品的芽片嫁接在实生砧的基部，然后再把指示植物的芽片嫁接在毒源芽片接口上方约２ｃｍ处。每样品／指示植物组合重复４次。第二年苗木发芽前，在指示植物接芽的上方约１０ｃｍ处剪除砧干。苗木发芽后摘除毒源芽的生长点，以促进指示植物嫁接芽的生长。定期观察指示植物的症状反应。

 

　　２结果与分析

 

　　２．１不同ＡＳＰＶ分离物摩擦接种草本指示植物后的症状分析

 

　　将不同ＡＳＰＶ分离物摩擦接种草本指示植物西方烟３７Ｂ约７ｄ后，接种叶片上出现白色坏死斑点、退绿斑、叶片皱缩畸形或小凸起等明显症状，而健康叶片未见明显症状（图１）。不同分离物接种的西方烟３７Ｂ各植株症状没有明显差别。同时在后期的观察中，系统叶片没有表现任何病症，由此可以判断ＡＳＰＶ各分离物只局部侵染西方烟３７Ｂ，而均未引起系统侵染。接种ＡＳＰＶ不同分离物的西方烟３７Ｂ各植株叶片均表现出了畸形、皱缩和坏死斑的相同症状，仅有ｊｆ３、ｐｖ１０、ｐｖ１１和ｐｖ１３四个分离物侵染的植株叶片额外有小凸起的症状。

 

　　２．２不同ＡＳＰＶ分离物二重芽接法木本指示植物后的症状分析

 

　　木本指示植物观察结果显示，杂种榅桲在初期表现不同程度的叶片反卷症状，有的分离物还有叶片黄斑、舟形叶症状，如分离物ｐｖ１３、ｊｆ５；至６月上旬植株矮化，８月初主干皮层表现坏死斑，后期剥开树皮，有的可见木质部的茎痘斑；光辉经ＡＳＰＶ侵染后主要表现叶片反卷、植株矮化，部分植株还会出现叶片皱缩、木质部茎痘斑的现象；５月下旬至６月上旬Ｓｐｙ２２７出现叶片反卷的症状，６月中旬以后主干皮层表面产生不规则的红褐斑，有些植株顶端枯死，生长衰退或矮化，木质部表面有凹陷斑（图２）。

 

　　从寄主范围来看，嫁接木本指示植物梨品种考密斯后，只有病毒分离物ｊｆ４和ｐｖ１０在梨品种考密斯上显现出沿叶脉退绿症状，接种的其他不同分离物并未呈现明显症状。ＡＳＰＶ分离物ｐｖ９、ｐｖ１３和ｊｆ１只侵染Ｓｐｙ２２７、杂种榅桲２种指示植物，不侵染光辉。其他的９个分离物的寄主范围相同，为杂种榅桲、Ｓｐｙ２２７和光辉。

 

　　不同分离物在不同指示植物上的症状较复杂，并未呈现明显规律性，因而单纯以生物学症状特点难以进行系统的ＡＳＰＶ株系分化分析。３种木本指示植物中，除个别分离物以外，光辉显现较为明显的病症时间普遍较晚，一般在６月下旬，和其他２种指示植物相比，大约晚１个月左右，且部分分离物不侵染光辉，较其他２种指示植物灵敏度弱。杂种榅桲较Ｓｐｙ２２７的症状反应种类更多，如叶片黄斑、退绿斑、舟形叶等，这种灵敏性更有利于区别同一病毒不同的株系。因此，杂种榅桲最适合做ＡＳＰＶ的指示植物，其次为Ｓｐｙ２２７，最后是光辉，这与王国平等［３，６］的报道基本一致。

 

　　３小结与讨论

 

　　当前研究中较多应用分子生物学方法对病毒进行鉴定及株系分化研究，如利用ＰＣＲ技术扩增某特定基因并通过测序获得核苷酸序列信息之后可进行病毒系统进化分析。从遗传学理论上来看，基于病毒不同分离物基因组核苷酸序列信息能够反应不同分离物间的亲缘关系，但某一特定基因上一个碱基的改变就可能使病毒的表型发生变化；反之，几个碱基的变化也可能不引起任何表型上的改变［４］。因此，单纯以核苷酸序列信息来划分株系也存在一定不足，而病毒的寄主范围及引起的病症等生物学特征可弥补此不足，因而病毒的生物学鉴定当前仍具有重要理论及应用价值。

 

　　ＡＳＰＶ在寄主植物上多呈潜伏侵染，不引起明显症状［１］，在受侵染的植株中病毒的浓度通常很低，因此进行生物学鉴定需要多种寄主植物同时检测。鉴定ＡＳＰＶ一般采用木本指示植物杂种榅桲、光辉、Ｓｐｙ２２７、梨品种考密斯和Ａ２０，同时结合草本指示植物西方烟37B进行［３，６］，除Ａ２０外，本研究选用了上述指示植物对ＡＳＰＶ进行了鉴定。试验结果表明，苹果属指示植物杂种榅桲、光辉和Ｓｐｙ２２７均能灵敏地检测出ＡＳＰＶ，表现典型症状，而梨属指示植物梨品种考密斯，只有ＡＳＰＶ分离物ｊｆ４和ｐｖ１０在其上显现出沿叶脉退绿，接种的其他不同ＡＳＰＶ分离物未呈现明显症状，提供的信息较少，因而尚需开发更有效的梨属指示植物。

 

　　王国平等［３］报道ＡＳＰＶ在梨品种考密斯上的早期表现为沿叶脉退绿，后期引起系统脉明症状。有研究表明脉明是一种光学幻觉（Ｏｐｔｉｃａｌｉｌｌｕｓｉｏｎ），烟草花叶病毒（Ｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＴＭＶ）侵染烟草后，温度若在２５℃以上则产生脉明，在４０℃以下随温度升高脉明程度增强［４］。本研究并未观察到脉明症状，分析其原因可能在于脉明症状表现时间较短，在观察时很可能错过了脉明症状的表现时间，而未能观察到脉明症状。

 

　　参考文献：

 

　　［１］ＪＥＬＫＭＡＮＮＷ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆａｐｐｌｅｓｔｅｍｐｉｔｔｉｎｇｖｉｒｕｓａｎｄｏｆｔｈｅｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅｏｆａｓｉｍｉｌａｒｖｉｒｕｓｆｒｏｍｐｅａｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｖｅｉｎｙｅｌｌｏｗｓｄｉｓｅａｓｅａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈｐｏｔｅｘａｎｄｃａｒｌａｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ，１９９４，７５：１５３５－１５４２．

 

　　［２］刘福昌，王焕玉．苹果潜隐病毒（Ｌａｔｅｎｔｖｉｒｕｓ）研究Ⅱ苹果品种和矮生砧木潜隐病毒鉴定［Ｊ］．植物病理学报，１９８９，１９（４）：１９３－１９７．

 

　　［３］王国平，洪霓，张尊平，等．我国北方梨产区主要品种病毒种类的鉴定研究［Ｊ］．中国果树，１９９４（２）：１－４．

 

　　［４］ＨＵＬＬＲ．马修斯植物病毒学（Ｍａｔｔｈｅｗｓ′ＰｌａｎｔＶｉｒｏｌｏｇｙ）［Ｍ］．范在丰，李怀方，译．北京：科学出版社，２００７．

 

　　［５］侯义龙．果树主要病毒ＲＴ－ＰＣＲ检测体系的建立、优化及病毒特异ＤＮＡ片段克隆测序研究［Ｄ］．沈阳：沈阳农业大学，２０００．

 

　　［６］王国平，王焕玉，张尊平，等．几种木本指示植物对苹果潜隐病毒敏感性的研究［Ｊ］．北方果树，１９９２（２）：８－１０．