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坐骨神经周围注射可乐定对CCI大鼠促炎性细胞因子表达的影响

时间:2018-10-29 15:24 文章来源:http://www.lunwenbuluo.com 作者:刘永峰 , 杨承祥 点击次数:

    【摘要】  目的:观察损伤坐骨神经周围注射可乐定对慢性坐骨神经结扎模型(chronic constriction injury,CCI)大鼠促炎性细胞因子表达的影响,探讨α2-肾上腺素受体激动剂是否对已经形成的神经病理性疼痛产生作用。方法:雄性SD大鼠32 只,随机分为4组,每组8只。Sham组:只分离皮肤、肌肉,不结扎坐骨神经;Sal组:形成CCI后注射生理盐水组;Clo组:形成CCI后注射可乐定组;Clo+Yo组:形成CCI后注射可乐定和育亨宾组。在注射药物3 d后急性处死动物,取患侧脊髓L4、L5、L6背根神经节采取全自动化学发光法检测TNF-α和IL-6浓度。结果:术后从7 d开始CCI大鼠脊髓背根神经节TNF-α和IL-6浓度有明显增高。损伤坐骨神经周围注射可乐定能明显抑制CCI引起的脊髓背根神经节TNF-α和 IL-6的表达(P<0.01)。结论:损伤的坐骨神经周围注射可乐定可以降低促炎性细胞因子的表达。
  【关键词】 可乐定;外周注射;CCI大鼠;神经病理性疼痛;TNF-α;IL-6
  神经病理性疼痛(neuropathic pain)是指由于神经系统受到损伤或产生病变而导致的疼痛。病理生理学特点主要表现为痛觉的高反应性,如痛觉过敏( hyperalgesia)、痛觉超敏(allodynia)及自发疼痛( spontaneous pain)等。神经病理性疼痛不同于由于组织损伤而导致的急性疼痛,通常呈慢性,可持续数天或数月,是目前临床治疗的难点之一。可乐定( clonidine)是α2-肾上腺素受体激动剂,临床上常用来治疗高血压。近年来发现它具有很好的缓解神经病理性疼痛的作用,多用于鞘内、静脉注射或伍用其他药物治疗慢性疼痛。本实验拟在经典的神经病理性疼痛模型CCI上,通过在结扎坐骨神经产生痛敏后,在损伤神经周围注射可乐定,探索外周注射可乐定是否对已经形成的疼痛产生影响,并通过检测促炎性细胞因子变化探索其可能参与的作用机制。
  1 材料与方法快速发表论文
  1.1 材料 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠,体重(200±20) g,由广东医学实验动物中心提供。动物置于(20±1) ℃和24 h昼夜循环的环境中,能够自由地获取水和食物。所有动物适应环境3 d后投入实验。盐酸可乐定注射液(035K0846)、盐酸育亨宾注射液(015K1444)以及TNF-α、IL-6试剂盒均购自美国Sigma公司。
  1.2 方法
  1.2.1 动物分组 随机将32只大鼠分为4组,每组8只。Sham组:只分离皮肤、肌肉,不结扎坐骨神经;Sal组:坐骨神经结扎后7 d注射生理盐水;Clo组:坐骨神经结扎后7 d注射可乐定组;Clo+Yo组:坐骨神经结扎后7 d注射可乐定和育亨宾组。
  1.2.2 CCI模型的建立 依照Bennet方法,大鼠腹腔注射10 %水合氯醛 (50 mg/kg)麻醉后,在一侧后肢剪毛消毒,在股骨外侧纵形切开皮肤,顺肌纹钝性分离肌肉,暴露坐骨神经,游离周围组织,用3.0丝线结扎坐骨神经中段,使神经外膜轻度凹陷,但不阻断血供,缝合皮肤。假手术组只钝性分离肌肉,暴露坐骨神经,游离周围组织,不结扎坐骨神经。术后7 d以MWT和TWL较基础痛阈下降40 %以上者视为CCI模型成功,投入实验。
  1.2.3 注射药物操作 CCI术后7 d,完成行为学测定后,水合氯醛麻醉动物。分别将1 mL生理盐水、1 mL盐酸可乐定注射液(150 μg/kg)和1 mL盐酸可乐定注射液(150 μg/kg)、盐酸育亨宾注射液(220 μg/kg)和生理盐水混合液吸入1 mL注射器。依照先前文献所示实验方法,在大鼠的大转子和坐骨结节间皮肤进针,然后向前内侧前进,沿坐骨神经走行扇形注射药液。在预试验中注射大鼠相同剂量的2 %利多卡因会使95 %受试大鼠产生短暂的单侧肢体麻木,证实药物注射在神经周围且发挥作用。
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  1.2.4 TNF-α和IL-6的测定 32只动物在注射药物3 d后,完成最后行为学测试,使用10 %水合氯醛麻醉动物,断头宰杀。收集4组每个动物患侧的L4、L5、L6的背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)。所有样本都被收集到1.5 mL的聚丙烯试管(无热源、经DNΑ酶和RNΑ酶处理),称重后立即放入干冰,随后所有收集的组织都以-80 ℃温度保存以待分析。以每毫克组织10 μL的比率加入正常细胞培养液和10 %灭活的牛血清,在冰浴中以超声匀浆器匀浆。然后以1 300×g速度离心,持续15 min,温度为4 ℃。取上清液继续保持4 ℃,1 500×g速度离心10 min。取上清液采用全自动化学发光法,使用全自动化学发光免疫分析仪对上清液进行TNF-α、IL-6含量测定。具体操作分别按TNF-α试剂盒和 IL-6试剂盒说明进行。重复测定2次,取其均值作为最后结果。
  1.2.7 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件进行分析,各组数据以均数±标准差(x±s)表示,两组均数间的比较采用t检验,多组均数间的比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
  2 结果
  2.1 动物模型行为表现 实验期间,所有大鼠均保持良好状态,无明显伤口感染现象。Sham组大鼠活动如常。结扎坐骨神经大鼠左侧(结扎侧)出现舔爪、跛行,安静时患足常保持防御姿势。患侧足趾并拢并呈轻度外翻状。注射可乐定后,舔爪、跛行等行为减轻。
  2.2 促炎性细胞因子变化
  2.2.1 TNF-α的变化 与Sham组相比,注射药物3 d后, Sal组和Clo+Yo组大鼠背根神经节TNF-α浓度明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。Clo组大鼠背跟神经节TNF-α浓度升高不明显,和Sal组、Clo+Yo组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。
  2.2.2 IL-6的变化 与Sham组相比,注射药物3 d后,Sal组和Clo+Yo组大鼠背根神经节IL-6浓度明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);Clo组大鼠背跟神经节IL-6浓度升高不明显,和Sal组、Clo+Yo组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。表1 促炎性细胞因子表达
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  3 讨论
  3.1 神经病理性疼痛模型 对神经病理性疼痛发病机制的研究大多来源于动物模型。Bennett和Xie等开发出的CCI模型与临床神经病理性疼痛特征有相似之处,制作过程相对简单而可靠,得到疼痛学界的广泛应用。该模型通过对坐骨神经松弛环扎,产生痛反应。可成功模拟神经病理性疼痛典型的自发痛、痛觉过敏和诱发痛等症状并能维持一段时间。CCI模型损伤区域近端神经纤维正常,无显著DRG细胞死亡证据。
  3.2 促炎性细胞因子和疼痛的关系 TNF-α是一类促炎性细胞因子,由活化的单核细胞和巨噬细胞产生,是其它促炎性细胞因子级联反应的始动因素,可以诱发其它IL-1、IL-6、IL-8等促炎性细胞因子的产生。在组织中TNF-α的水平和一些疼痛和痛觉过敏的程度有关[1,2]。皮下注射 TNF-α可以降低大鼠腓神经C-伤害感受器对机械刺激的激活阈值[3]。有研究发现,阻断TNF-α可使各种神经病理性疼痛模型大鼠或小鼠的痛觉增敏 [4-5]。神经损伤后,雪旺氏细胞也产生TNF-α,表明其与神经病理性疼痛有着密不可分的关系[6-7]。IL-6是另一种促炎性细胞因子,和神经病理性疼痛的形成和维持有极大关系[8]。激活的免疫细胞产生IL-6的过程和神经病理性疼痛有着密切联系。对于这点,早在1996年,DeLeo JA等[9]学者就对此做了相关的研究。他们制作成功坐骨神经冷冻大鼠模型(sciatic cryoneurolysis, SCN)后,使用免疫组化实验定位大鼠的脊索,显示在脊髓灰质和运动神经元IL-6的水平要高于正常对照大鼠。进一步实验又发现,在鞘内注射重组人IL- 6正常大鼠,对正常触觉会产生异常性疼痛。这样,有理由认为,降低TNF-α和IL-6等促炎性细胞因子的产生可以改变慢性疼痛的发生和维持,对其产生的痛敏反应也会产生影响。
  3.3 CCI术后促炎性细胞因子和α2-肾上腺素受体变化 坐骨神经结扎可以导致轴突损伤、局部炎症反应和华勒氏变性(Wallerian degeneration,WD)。神经束损伤后,首先活化神经内膜的成纤维细胞,产生部分趋化分子参与宿主防御反应。这些趋化分子使免疫细胞(主要是中性粒细胞和巨噬细胞)从循环中向神经聚集,产生促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1、IL-6)、NO、活性氧类(ROS)等参与免疫反应[10]。同时成纤维细胞产生的这些物质也直接使神经兴奋、损伤神经髓质以及改变血-神经屏障,从而使神经水肿,继而使更多的免疫细胞、抗体等浸润,同时也改变临近神经纤维的结构和功能[11]。除了成纤维细胞,神经内膜一些驻留型的巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞、上皮样细胞也被活化,也释放部分TNF-α和IL- 6等促炎性细胞因子,以及NO、ROS等免疫细胞趋化因子。还有包绕在外周神经周围的雪旺氏细胞活化,同样也会释放TNF-α和IL-6等促炎性细胞因子。TNF-α和IL-6等促炎性细胞因子可使外周神经脱髓鞘以及变性,增加传入神经的兴奋性,产生神经病理性疼痛[12]。同时,TNF-α和IL-6 等促炎性因子使损伤外周神经产生炎性反应可释放P物质,而P物质可使免疫细胞释放促炎性因子,从而形成P物质-促炎性细胞因子正反馈环。二者相互作用,加剧疼痛的发展。还有学者发现,TNF-α和IL-6等促炎性因子也可以逆向转运到背根神经节,引起背根神经节的交感神经出芽,从而产生神经病理性疼痛[13]。所以我们有理由认为TNF-α和IL-6等促炎性因子是产生神经病理性疼痛的重要因素,同时也是痛信号向背角传递的重要介质之一。
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  外周神经损伤可以导致损伤神经局部α2-肾上腺素受体增多,从而导致痛觉过敏以及疼痛[14]。坐骨神经结扎48 h后,在神经损伤部位可有α2-肾上腺素受体免疫反应性增强以及其和配体的结合增强[15-16]。对于神经损伤大鼠,注射去甲肾上腺素可以使30 %~50 %的C纤维兴奋[17]。但这种作用可以被α2-肾上腺素受体激动剂所阻滞。
  3.4 外周注射可乐定对促炎性细胞因子的影响 大鼠施行CCI术后,BDG中TNF-α和IL-6的表达明显增高。患侧坐骨神经周围注射可乐定可使CCI大鼠BDG中TNF-α和IL-6的表达降低,育亨宾可以阻滞这种作用,这和外周注射可乐定减轻痛敏的作用相似。可以认为外周可乐定注射对 CCI大鼠BDG中TNF-α和IL-6表达的影响也与α2-肾上腺素受体有关。先前的研究发现,外周注射可乐定可发挥α2-肾上腺素受体作用使酵母多糖注射诱发神经炎性痛模型中T-淋巴细胞和单核/巨噬细胞调亡,从而减少了促炎性细胞因子表达。同时还认为α2-肾上腺素受体激动剂刺激神经微环境改变促炎细胞性因子细胞表型,使促炎性细胞因子表达减少[14]。此研究结果也和本实验的结果相同。
  综上所述,外周注射可乐定通过作用于α2-肾上腺素受体发挥免疫调制作用,使诱发聚集在此的免疫细胞调亡,从而减少了促炎性细胞因子以及神经生长因子的产生。可乐定改变成纤维细胞、巨噬细胞、胶质细胞等免疫细胞释放TNF-α、IL-6等促炎性因子表型,减少促炎性细胞因子的产生,从而使促炎性细胞因子向中枢的传送减少,减轻中枢致敏,从而产生止痛作用。对于临床上常见的外科手术、肢体离断等并发的顽固性慢性疼痛,可以尝试以外周注射可乐定作为治疗的的选择。
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