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【关键词】  RNA干扰; 睫状神经营养因子(CNTF); 大鼠; 体外实验

　　　RNA干扰(RNAi)是近年发展起来的一项具有巨大医疗应用潜力的反向遗传学技术[1]。该技术有双链干扰RNA设计与合成、序列有效性的体外实验验证和体内实验等重要环节[2]。其中，前两个环节是保证实验成功的先决条件。与植物和低等动物不同，在哺乳动物细胞内进行RNA干扰的条件更加苛刻，尚存在许多困难。比如，体外实验中，小干扰 RNA(siRNA)的设计和有效性验证必须依据特定的规律[3-5]，并且对操作的要求较高。尽管如此，我们在实验中不断总结经验教训，认为很多siRNA的设计、合成和效应验证在操作上有很强的规律可循，具备一定经验后就能事半功倍。因此，我们以大鼠睫状神经营养因子 (ciliary neurotrophic factor, CNTF)的RNA干扰为例，介绍siRNA设计合成及其体外有效性验证的全过程，，希望这些经验能够为其他实验人员提供一些有帮助的信息。

　  1 材料和方法

　　1.1 大鼠CNTF siRNA分子的设计合成和修饰

　　在PubMed主页(网址http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)中，大鼠CNTF的cDNA序列链接 Accession号为 “NM_013166”。进入Invitrogen公司的BLOCK?iTTM RNAi Designer主页，选择“siRNA”设计模式(即19nt靶序列选择)，然后依次进行如下操作：将大鼠CNTF mRNA的Accession号输入到“Accession number”对话框中，勾选“Open reading frame(ORF)”选项(表示在开放读码框中寻找靶序列)，选择物种为“Rat?Rattus norvegicus”，选定G/C百分比为35%～55%[3]，选定“Default motif pattern”，最后点击设计按钮。系统自动给出多个候选靶序列，并根据每个序列符合规则的程度给出各自评分。本实验选择评分较高的3个靶cDNA序列依次排列，序列1：GCAAACACCTCTGACCCTT;序列2：GGTGACTTCCATCAGGCAA;序列 3：TCCATGACCTTCGTGTCAT。通过网页上的“siRNA to Stealth RNAiTM siRNA”选项将三者转换为25nt序列(向5′?端延长6nt)后，序列1：CGCAGAGCAAACACCTCTGACCCTT，序列 2：ACTGAAGGTGACTTCCATCAGGCAA，序列3：GGTCTATCCATGACCTTCGTGTCAT;系统同时自动设计出对照序列。根据靶序列设计出3个siRNA分子。siRNA1正义链：5′?CGCAGAGCAAACACCUCUGACCCUU?3′，反义链：3′ ?GCGUCUCGUUUGUGGAGACUGGGAA?5′;siRNA2正义链：5′?ACUGAAGGUGACUUCCAUCAGGCAA?3′，反义链：3′?UGACUUCCACUGAAGGUAGUCCGUU?5′;siRNA3正义链：5′? GGUCUAUCCAUGACCUUCGUGUCAU?3′，反义链：3′?CCAGAUAGGUACUGGAAGCACAGUA?5′。转染操作的对照序列(按cDNA)为：CGCACGAACAACTCCCAGTCGACTT，同上设计出对照siRNA分子。本实验的siRNA均为25nt两端齐平设计。3个siRNA分子及其对照物均由Invitrogen公司化学合成，脱盐法提纯，5′?端行Cy3荧光基团标记。

　　1.2 其他主要试剂用品

　　Lipofectamine 2000(Invitrogen)，DMEM培养液(Hyclone)，兔抗大鼠GFAP抗体(Sigma)，兔抗大鼠Vimentin抗体(博奥森)，兔抗大鼠S100抗体(博奥森)，兔抗大鼠CNTF抗体(博奥森)，胰酶(Sigma)，Cy3标记羊抗兔第二抗体(中杉金桥)，反转录和PCR试剂盒 (Fermenta);DNA标准参照物(华美)，24孔培养板(Costar)。

　　1.3 主要仪器

　　高压蒸汽灭菌器(Sanyo)，倒置荧光显微镜(Zeiss)，数码相机(Olympus，带专用订制接口)超净工作台(苏州净化)，二氧化碳孵箱(Sanyo)，PCR仪(Bio?Rad)，水平电泳仪(北京六一)，微量加样枪(DISHI)，凝胶成像系统(ChemiDoc)，低温冰箱 (Sanyo)，离心机(Bio?Rad)。

　　1.4 实验动物发表论文网

　　成年健康SD大鼠，由四川大学实验动物中心提供。雌雄合笼使其自然交配。雌鼠孕期给予孕鼠全价饲料，饮水经煮沸消毒处理并可自由摄取，饲养间环境温度18～24 ℃，自然光照。分娩后3天(本实验3种细胞的培养均取自该日龄)，取乳鼠行断颈处死，整体浸泡于70%乙醇30 min后，置于超净台中的无菌培养皿内，解剖取材进行细胞培养。

　　1.5 细胞培养

　　本实验分别培养了施万细胞、嗅鞘细胞和成纤维细胞。施万细胞取自坐骨神经干，操作程序参考Manson 等[6]的方法;待细胞形态完全恢复梭形(大约3 d)即进行传代，16 h后单独用Lipofectamine 2000模拟转染细胞(见“1.6”)，继续培养72 h，用S100免疫组化鉴定并观察。嗅鞘细胞取自嗅球，采用李绍波等的操作程序[7]，纯化后培养7 d进行传代，16 h后同上用Lipofectamine 2000处理，继续培养72 h，用GFAP与p75鉴定并观察。成纤维细胞取自肾脏，参考Alvarez等的方法[8]，血清浓度5%，细胞融合率达90%时进行传代，传代后处理同上，用Vimentin免疫组化鉴定并观察。以上细胞在纯化培养完成后，消化转瓶的过程中不减少细胞总数;所有培养液体不加抗生素。细胞观察计数在倒置显微镜下拍照并用ImagePro 5.0软件辅助分析，记录每高倍(40×10)视野下细胞的面积占视野总面积的比例，作为细胞的融合度(conflurency);随机计数5个视野(视野不能含有培养板的底部边缘)后取平均值作为该孔的融合度;一共计数6个孔取平均作为本组的细胞融合度。

　　1.6 siRNA体外转染操作

　　成纤维细胞以3×105个/ml的密度传代一次后，待细胞融合率达50%时，常规胰酶消化，不分瓶直接重新接种于D?多聚赖氨酸铺底的24孔板，每孔加入不含血清的DMEM培养基0.2 ml。其中6个孔在传代后16 h时进入转染程序，另6个在传代后48 h时进行。转染时，所有液体、容器和有可能接触标本的用具都要用DEPC处理后行高压灭菌。首先，摇匀Lipofectamine 2000原液，取6 μl，用300 μl DMEM培养基稀释，摇匀后室温(20 ～ 25 ℃)孵育5 min。然后取20 μmol/L siRNA原液6 μl，用300 μl DMEM培养基稀释于Eppendorf管中，轻轻翻转混匀。将Lipofectamine 2000稀释液和siRNA稀释液混合，轻轻翻转混匀，室温下孵育20 min。在此期间如果液体变浑浊并不影响效果。弃去培养板孔中的培养基，立即加入上述混合液，每孔100 μl。对照siRNA的转染操作方法与上述相同。转染过程需要避强光。转染后，细胞置于原培养条件(37 ℃，5% CO2)下继续培养，6 h后在倒置荧光显微镜下观察是否成功转染;分24，48和72 h三个时间点取材检测，每个时间点检测12个孔，其中6个为待检siRNA孔，6个为对照孔。

　　1.7 RT?PCR分析

　　用Premier 5.0软件设计大鼠β?肌动蛋白和CNTF的引物序列。β?肌动蛋白引物上游序列：5′?GTAAAGACCTCTATGCCAACA?3′，下游序列：5′?GGACTCATCGTACTCCTGCT?3′，扩增产物预计227 bp;CNTF引物上游序列：5′?CTTTCGCAGAGCAAACACCT?3′，下游序列：5′?CATCCCATCAGCCTCATTTT?3′ ，扩增产物预计422 bp。按说明书指示的流程进行操作，反应体系的总体积为25 μl;PCR扩增条件：94℃预变性(3 min)，以94℃变性45 s，51℃退火45 s，72℃延伸1 min为一个循环，35个循环后，72℃延伸5 min。15 g/L琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，在凝胶成像仪上观察拍照，用ImagePro 5.0软件测定并计算CNTF与β?肌动蛋白扩增产物条带的平均灰度与条带面积乘积的比值，作为CNTF mRNA的相对含量。发表论文网

　　1.8 免疫荧光组织化学检测

　　将细胞培养板内的液体倒掉，用D?Hanks液快速漂洗2次，加入4℃预冷的95%乙醇铺满培养板底面，固定15 min。倾去乙醇，用PBS漂洗3次，每次2 min。滴加2%牛血清白蛋白PBST溶液封闭15 min，倾去后不洗直接滴加用PBS 1∶200稀释的CNTF抗体工作液，37℃孵育1 h后转入4℃冰箱孵育16 h。PBS漂洗3次，每次5 min。滴加PBS 1∶200稀释的荧光二抗，37℃避光孵育1 h。PBS避光漂洗3次，每次3 min。倒置荧光显微镜下观察、测定细胞的平均荧光强度(灰度)值并照相。

　　1.9 数据统计分析

　　用SPSS 16.0软件进行数据分析，采用组间t检验，P<0.05认为差别具有统计学意义。数据导入Excel 2003绘制直方图。

　　2 结 果

　　2.1 经过传代和Lipofectamine 2000处理后成纤维细胞的融合度最高，符合转染要求

　　经过传代和Lipofectamine 2000处理，如图1所示，施万细胞的融合度大大下降，嗅鞘细胞的融合度也明显降低，两者都不能满足常规siRNA转染的要求。成纤维细胞经过两次传代，细胞密度增加，细胞生长良好，满足转染要求。

　　2.2 在传代后16 h时进行转染操作，siRNA能够成功进入成纤维细胞

　　转染操作6 h后观察，如图2，传代后16 h转染组成纤维细胞90%以上带有红色荧光标记，证实siRNA已经成功转染成纤维细胞。传代后48 h转染组成纤维细胞很少见到荧光标记。

　　2.3 不同siRNA分子和不同转染条件下CNTF免疫荧光强度的变化

　　如图3所示，在传代后16 h进行转染操作，转染后24，48，72 h这3个时间点，3种核苷酸序列不同的siRNA分子所致的CNTF免疫荧光强度降低的程度是不同的。其中，siRNA2组各时间点CNTF免疫荧光强度无显著改变;siRNA1和siRNA3组可见在72 h时CNTF免疫荧光强度下降显著(P<0.01)，两组分别下降至对照siRNA转染组的82%和61%。

　　2.4 siRNA3转染后CNTF mRNA水平显著下降

　　如图4，5，经RT?PCR分析可见，siRNA3转染后24 h，成纤维细胞的CNTF mRNA已经显著降低到对照siRNA转染组的14%，此后一直维持低水平。

　　3 讨 论发表论文网

　　本实验的主要内容为RNA干扰技术中siRNA的设计和有效性检验环节的操作。通过一系列操作，成功筛选出针对大鼠CNTF的相对有效的 siRNA3分子，并在最佳条件下使体外培养的成纤维细胞的CNTF mRNA和蛋白水平分别降低到对照siRNA转染组的14%和61%。

　　在包括CNTF等多种分子在内的RNAi实验中，我们根据操作经验，总结出大致相似的如下几个步骤。首先，根据目标蛋白的mRNA全长序列，按照经验规则[3-5]选择候选靶序列及其对照序列，并完成同源性检测;靶序列一般选择 3个，如果后续试验发现全部无效再作补充，否则数量多了会大大增加开支。选择靶序列和设计siRNA有很多自动化工具可用，我们应用后认为 Invitrogen公司的BLOCK?iTTM RNAi Designer比较全面和方便。此外，像麻省理工学院Whitehead研究所的siRNA设计程序和日本基因网SiDirect siRNA序列分析程序等得出的结果也值得参考，以上程序都可以在互联网上免费使用。siRNA分子可以是传统的19nt加上?dTdT等突出尾巴，也可以不采用19nt突出结构，评判是否有效的唯一方法就是通过实验验证。第二，根据靶序列设计出siRNA分子，确定siRNA分子的修饰类型，并交由专门的公司或实验室合成;siRNA合成修饰不是本文的重点内容，大多数研究形态或者功能的实验室也不需要常规进行这些操作。第三，通过文献查阅确定哪些细胞表达目标蛋白，然后用体外培养预实验确定：这些细胞中哪种或哪些细胞既能表达目标蛋白又比较容易转染。需要注意的是，为了检测细胞的生长特性和存活能力，传代过程不要降低细胞的总数。比如本实验通过体外培养发现，成纤维细胞高表达CNTF，而且传代后经过Lipofectamine 2000作用，仍然能生长和增殖，最符合转染操作的要求。如果有现成的细胞株或细胞系可以利用，仍然有必要进行上述预实验，因为细胞系或细胞株在多次传代后有可能丢失某些分子特点，甚至于其来源和属性都可能存在疑问[9]。如果实验室已经有相应细胞的培养经验，这一步上将会节约大量时间。第四，细胞消化传代(植板时不要减少细胞密度)并于16 h左右进行转染操作，大约6 h后镜下观察。之所以要在消化后16 h左右进行转染，是因为经过实验我们发现，细胞生长时间过长或过短，常规脂质体转染的成功率会大大下降。转染后6 h首次观察的目的是借助siRNA分子修饰基团(如荧光基团或酶)的成像确定siRNA是否已经进入细胞内;成功转染的细胞数应该在细胞总数的70%以上才具有意义[10]。至于siRNA的有效浓度，我们认为有必要进行预实验。因为浓度太低没有明确的干扰效果，浓度太高会因Lipofectamine 2000用量的增加而致使较多的细胞死亡。本文采用的浓度就是CNTF体外干扰的最佳浓度(本文中未显示该项预实验的数据)。第五，在转染成功的前提下继续培养，分多个时间点对各组细胞进行目标蛋白的免疫荧光组织化学检测，选出干扰效果最好的siRNA分子。时间点的选择可从转染后24 h开始，到72 h结束，只要有效，一般都能看到荧光强度减弱。虽然在哺乳动物细胞，常规脂质体转染的RNAi由于siRNA不能在细胞内复制和长期存在[11]，其维持时间往往不超过170 h，但在siRNA分子有效性检测的环节，时间点没有必要选择那么长。最后，设计目标蛋白对应mRNA的RT?PCR引物(如果能从文献上或本实验室的数据库中获得准确信息更好)，用通过免疫荧光检测选出的最有效的siRNA进行体外RNAi操作，分时间点取出细胞进行RT?PCR检测，进一步验证 mRNA水平是否被显著降低。

　　我们在siRNA有效性验证实验中，并没有先检测mRNA再检测蛋白，而是先通过免疫荧光检测找出最能降低蛋白表达水平的siRNA分子。这样做的原因有两方面：其一，蛋白水平的变化直接与功能相关，后续实验中RNAi是否有意义和能否起到人工干预效果，取决于蛋白表达是否降低，而不只是 mRNA水平的下降;其二，RT?PCR不论从成本还是操作的繁琐程度来说，都要高于免疫荧光检测。因此，我们在有效性验证的常规实验中反其道而行之，先看蛋白变化并找出最有效的siRNA分子，再看这种变化是否有mRNA水平降低这个基础条件，从而最终肯定所选siRNA分子的干扰效能。这样既快捷又节省费用。如果看不到免疫荧光强度的明显改变，再做一下蛋白质印迹是值得的。某些分子的RNAi操作中，mRNA水平降低后，蛋白水平始终不下降。虽然有的体内实验尝试每隔24 h到48 h反复转染取得了效果[12]，但是我们在实践中发现这一做法在体外实验中经常是不能见效的，Lipofectamine 2000可能有一定细胞毒性，多次转染后细胞数量有明显下降(本文未显示该数据)，况且这样达到的干扰效果即使用到体内实验中也将没有实际用途。所以如果发现这类蛋白水平难以降低的目标蛋白分子，往往有必要考虑改变转染方法，甚至调整实验的技术路线。

　　siRNA的脂质体转染技术虽然比较“传统”，但目前是进行体外RNAi操作的最常规且相当简便的方法。除了用具与液体必须杜绝RNAse外并没有需要特别小心的问题。成功地验证一个功能性的siRNA分子，就意味着在某个目标蛋白的研究中多了一个工具，并且根据相应的靶mRNA序列还能够设计出同样有效的短发夹状RNA(shRNA)分子，通过病毒载体等其他手段进行RNAi实验。因此掌握了siRNA的设计和有效性验证方法，就为RNAi实验奠定了基础。但是，本文的方法并不适用于所有的分子。这套方法对于存在以下问题的分子不适合：①只在神经细胞或其他某些难以分离传代的细胞上表达，这种情况需要使用病毒载体进行转染;②mRNA序列不长缺少选择余地，或者选择的靶序列经实验验证无一有效，或者设计的siRNA与管家基因有冲突，这些情况解决起来尚有困难;③目标蛋白半衰期太长，或者细胞内有大量储备，一时难以消耗掉，这种情况下有可能观察不到免疫荧光强度的降低，如有必要需直接用 RT?PCR检测来筛选有功能的siRNA分子。

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