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    【摘要】　目的：研究高浓度葡萄糖对体外培养的视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞增生以及活性氧（reactive oxygen species,ROS)生成的影响。方法：体外培养人RPE（ARPE?19），随机分成4组，即正常对照组用含5.6mmol/L葡萄糖的DMEM /F12培养液，高糖组用30mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养液，高糖+SB203580组用p38?MAPK特异性阻断剂SB203580 10μmol/L预处理 30min后，再用含30mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养液，甘露醇组（渗透压对照组）用含5.6mmol/L葡萄糖和24.4mmol/L甘露醇的DMEM/F12培养液。各组培养48h用MTT法检测各组视网膜色素上皮细胞的增生活力，用CM?H2DCFDA荧光染色检测RPE细胞中ROS 的产生量。结果：与对照组相比,高糖培养人视网膜色素上皮细胞48h可以导致RPE细胞的损伤，抑制RPE细胞增殖，并使ROS生成增加，在一定程度上，与p38?MAPK途径的激活有关。结论：高糖培养ARPE?19可致细胞损伤，抑制增殖，并使ROS生成增加。

     【关键词】 高浓度葡萄糖；活性氧族；p38丝裂原活化蛋白激酶；视网膜色素上皮细胞

　　　　0　引言

　　糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）是糖尿病严重的并发症之一。高糖是DR的主要致病因素，血糖水平的控制可以影响DR的发生发展已是广泛的共识。近年来的研究表明，氧化应激作为一种病理过程参与了许多严重眼底疾病的发病机制。活性氧（reactive oxygen species, ROS）自由基损害在氧化应激中起重要作用。视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞是血?视网膜屏障主要的组成部分，在维护视网膜正常生理功能方面具有重要的作用[1]。研究发现，高糖可以造成视网膜色素上皮细胞的损伤， 影响视网膜外屏障功能[2]，但其确切的分子机制尚不清楚。p38信号通路（p38 mitogen activated protein kinase,p38?MAPK）是一条应激敏感的通路，高糖刺激可以激活p38?MAPK，使其磷酸化表达增加，发挥信号转导作用。我们研究高糖对 RPE细胞生长的影响以及与此相关的分子机制，尤其关注高糖对RPE产生ROS的影响，以及p38?MARK通路在此过程中的作用。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　人视网膜色素上皮细胞（cultured human retinal pigment epithelial cells?19，ARPE?19）购自ATCC公司，DMEM/F12培养液（Gibco公司），胎牛血清（FCS，中美合资兰州民海生物），胰蛋白酶（Gibco公司），二甲基亚砜（DMSO, Sigma公司），四甲基偶氮唑（MTT，Sigma公司），SB203580（碧云天生物科技），流式细胞仪（BD FACSCalibur）。

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　　1.2　方法

　　ARPE?19悬液置于含有100mL/L FCS的DMEM/F12培养液的培养瓶内，于37℃, 50mL/L CO2 培养箱中培养，隔天换液，待细胞长至融合后，用0.5g/L胰蛋白酶?0.2g/L EDTA消化，离心，制成单细胞悬液，按1∶4～ 1∶6 传代。将长至融合状态的细胞以0.5g/L 胰蛋白酶?0.2g/L EDTA消化，离心，制成单细胞悬液，置于含5.6mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养液中培养24h后弃除培养液，用PBS漂洗2次分成4组，即正常对照组用含5.6mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养液，高糖组用30mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养液，高糖+SB203580组用p38?MAPK特异性阻断剂SB203580 10μmol/L预处理 30min后，再用含30mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养液，甘露醇组（渗透压对照组）用含5.6mmol/L葡萄糖和24.4mmol/L甘露醇的DMEM/F12培养液，以上各组均培养48h，于倒置显微镜下观察拍照。

　　1.2.1　增殖活性的测定

　　取生长状态良好的ARPE?19细胞，采用上述传代方法消化，制成细胞悬液，计数，以106个/L接种于96 孔板，每组设复孔且每孔的细胞数保持一致，加入等量培养液200μL /孔，置于37℃，50mL/LCO2培养箱中培养48h；每孔加入5g/L MTT溶液20μL，置于37℃，50mL/L CO2培养箱中继续培养4h，终止培养，小心吸弃培养液，每孔加入DMSO 150μL，室温振荡10min；在酶联免疫检测仪上测定各孔490nm的吸光度（A490）值绘制生长曲线。

　　1.2.2　细胞内ROS产生的检测

　　RPE细胞消化后，接种细胞悬液于25cm2 的培养瓶，置于37℃，50mL/L CO2 培养箱中培养24h后，按以上分组予以干预，分别培养48h。吸弃培养液，用预冷的PBS洗3min,3次，加入现配的CM?H2DCFDA 2.0mL，置于37℃ 50mL/L CO2培养箱中避光孵育30min，吸除染液，PBS洗3次，最后加入PBS 1.0mL。流式细胞仪记录各组ROS水平：波长488nm氩离子激光，观察至少50000个细胞，波峰右移，表明ROS含量高。

　　统计学分析：实验重复3次，测到的数据采用SPSS 17.0统计学软件进行ANONA方差分析和配对t检验，数据以均数±标准差（±s）表示，以P<0.05为有统计学差异。

　　2　结果

　　2.1　ARPE?19形态学变化

　　正常对照组RPE细胞在倒置显微镜下观察呈长梭形或三角形为主，胞体不透明，细胞内可见少许黑色或棕褐色色素颗粒，细胞排列规则、紧密（图 1A）。而在葡萄糖浓度为30mmol/L的DMEM/F12培养液中，细胞胞体变薄，不规则形状细胞增多，形态呈现多样性（图1B）。加入 p38?MAPK特异性阻断剂SB203580 10μmol/L预处理 30min后，再置于葡萄糖浓度为30mmol/L的DMEM/F12培养液中，细胞形态也有变化，不规则细胞增多（图1C）。甘露醇组细胞形态与正常对照组相比没有明显变化（图1D）。

　　2.2　ARPE?19增殖活力

　　高糖组(A490=0.302±0.034)细胞活力明显低于正常对照组(0.428±0.015)，差异有显著性（P<0.01）；加入SB203580预处理组，细胞活力(0.363±0.011，P<0.05)比高糖组高，但仍然较正常组偏低，差异有统计学意义；与正常对照组相比，甘露醇组细胞活力无明显变化（0.416±0.022）。结合细胞形态的变化，我们发现高浓度葡萄糖抑制细胞增生，甚至引起细胞死亡（表1）。表 1RPE细胞活力（略）

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　　2.3　产生活性氧的影响

　　与对照组相比，高糖组及加入SB203580预处理组RPE细胞内ROS的表达量增高，差异具有统计学意义（P＜0.01，图2)；高糖组与加入SB203580预处理组RPE细胞内ROS的表达量相比，差别有统计学意义（P＜0.05)，其中高糖组RPE细胞内ROS的表达量均较其余组高；对照组与甘露醇处理组RPE细胞内ROS的表达量无统计学意义。高糖组及高糖+SB203580组与正常对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）；高糖+SB203580组与高糖组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。

　　3　讨论

　　糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病的严重并发症，严重者甚至导致视力丧失。高糖是DR的主要致病因素，控制血糖可以影响DR的发生发展。我们的研究结果显示，高浓度葡萄糖可以抑制RPE细胞的增殖，高糖组细胞增殖活力受到明显的抑制，RPE细胞内ROS的表达量增高，其中高糖组的RPE细胞内ROS的表达量均较其余组高，提示高糖能够促进RPE细胞ROS的产生同时抑制培养的RPE细胞增生。Mayumi等观察到高糖可使细胞增长受到抑制 [3]，可以促进血管内皮细胞和周细胞凋亡，而Lee等进一步证实，高糖作用下小鼠心脏内皮细胞间连接蛋白减少，使细胞形状发生改变，可以造成大分子物质的渗漏[4]。我们用含30mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养液处理RPE细胞48h，倒置显微镜下观察，细胞胞体变薄，不规则形状细胞增多，形态呈现多样性。用MTT法检测细胞活力结果显示，高糖组细胞活力明显低于正常对照组（P<0.01）；而与高糖相同渗透浓度的甘露醇组对RPE细胞的形态和活力并不产生明显的影响。以上结果显示，高糖刺激可以抑制视网膜色素上皮细胞的增殖，且此抑制作用与高浓度葡萄糖造成的高渗透压无关。

　　活性氧是一种化学性质比氧分子更加活泼的小分子物质，细胞内ROS主要是在细胞能量代谢过程中产生的超氧阴离子、少量过氧化氢以及它们的转化产物羟自由基等，细胞在生理状态下不断产生ROS，同时机体存在清除和抑制自由基产生的系统，一旦平衡被打破，过多的ROS自由基可以直接攻击靶器官造成组织器官损伤，以及生物大分子如DNA，RNA，氨基酸等的结构破坏[5]。CM?H2DCFDA作为一种荧光染色剂可以通过细胞膜快速进入细胞，当细胞内存在 ROS时，CM?H2DCFDA可以被氧化为发出荧光的DCF，其荧光强度与细胞内ROS成正比，我们通过CM?H2DCFDA荧光标记检测细胞内 ROS。结果表明，高糖可以明显增加RPE细胞内ROS的产生。RPE细胞含有丰富的线粒体，代谢旺盛，对氧需求量大。有研究发现，RPE细胞氧化损伤的主要靶细胞器是线粒体，损伤水平取决于活性氧的量，RPE细胞线粒体DNA对ROS介导的损伤非常敏感，而RPE细胞中线粒体DNA的损伤又可以使ROS 的产生增加、电子转运减少，进一步加重RPE细胞功能障碍[6]。在高糖状态下产生的ROS不仅可以造成细胞氧化损伤，还是高糖的信号转导分子 。MAPK是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它存在于大多数细胞内，是真核细胞转导细胞外信号到细胞内引起细胞反应的一类重要信号系统。其中的 p38MAPK通路参与了细胞的生长发育及细胞间功能同步等多种生理过程，并与炎症、应激反应的调控密切相关，被认为是细胞信息传递的交汇点和共同通路 [7]。本实验以p38MAPK特异性抑制剂SB203580预处理RPE细胞，研究了p38信号通路在高糖诱导的RPE细胞氧化损伤过程中的作用。结果显示，以p38MAPK特异性抑制剂 SB203580预处理RPE细胞，再给予高糖刺激，ROS的表达量有所减少，与单独高糖干预组相比差别有统计学意义（P＜0.05）。

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　　综上所述，高浓度葡萄糖可以引起培养的人RPE细胞氧化损伤，使细胞形态和活力发生变化，损伤的机制可能是高糖诱导RPE细胞产生大量ROS,同时使细胞抗氧化能力下降，激活RPE细胞p38MAPK，经过细胞内信号转导，过量的ROS可以通过细胞毒作用和细胞抑制作用造成RPE细胞损伤，参与DR的发生、发展。

     参考文献： 

 　　1　Naggar H, OIa MS, Moore P, et al. Down regulation of reduced?folate transporter by glucose in cultured RPE cells and in RPE of diabetic mice.

　　Invest Ophthalmol Vis Sci2002;43(2):556

　　2　Cai J, Wu M, Nelson KC, et al. Oxidant?induce apoptosis in cultured human retina pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 1999;40(5):959?966

　　3　Jin GF，Hurst JS，Godley BF. Hydrogen Peroxide stimulates apoptosis in cultured human retinal pigment epithelial cells. Cur Eye Res 2001;22(3):165?173

　　4　Seko Y，Pang J, Tokoro T, et al. Blue light?induced apoptosis in cultured retinal pigment epithelium cells of the rat. Graefes Arch Clin Exp

　　Ophthalmol 2001;239(1):47?52

　　5　Lu H，Hunt DM,Ganti R, et al. Metallothionein protects retinal pigment epithelial cells against apoptosis and oxidative stress. Exp Eye Res 2002;74(1):83?92

　　6　Siuv AW,Reiterv RJ，To CH. Pineal indoleamines and vitamin E reduce nitric oxide?induced lipidper oxidation in rat retina lhomogenates.

　　Pineal Res 1999;27:122?128

　　7　Chang L, Karin M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature 2001;410(6824):37?40